液相色譜儀分析方法開發(fā)你學(xué)會(huì)了嗎？液相色譜儀是一種實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用來分析數(shù)據(jù)的一種儀器，是一種高效且準(zhǔn)確的分析方法，而分析方法在不同的行業(yè)中就有不同的要求，部分行業(yè)對(duì)質(zhì)量控制有很高的要求，液相色譜儀分析方法是質(zhì)量控制的重要手段，那么液相色譜儀分析方法開發(fā)你學(xué)會(huì)了嗎？接下來和天恒儀器小編一起了解一下吧。

液相色譜主要有親水色譜、正相色譜、反相色譜、離子交換色譜、凝膠滲透色譜/體積排阻色譜等幾種色譜分離模式。其中反相色譜是到目前為止*通用的 HPLC 方法，大約占所有方法的 60%，將近 95% 的色譜工作者都在使用。那么本文我們主要來講反相色譜分析方法的開發(fā)。

反相色譜的原理：分析物與疏水固定相之間發(fā)生非極性、非特異性相互作用，即分析物在極性流動(dòng)相和非極性固定相之間分配，與正相色譜相反。反相色譜柱通常使用的固定相有C18、C8苯基。反相色譜系統(tǒng)通常使用的流動(dòng)相有:a. 水，可含緩沖液，或用酸或堿調(diào)節(jié)pH ， b . 可與水混溶的有機(jī)溶劑。

如何來開發(fā)一個(gè)合理可行的反相色譜分析方法，這其實(shí)是每一個(gè)色譜工作者必須面對(duì)并解決的問題。分析方法的開發(fā)其實(shí)主要是選擇合適的色譜柱、流動(dòng)相、檢測(cè)波長來得到一個(gè)初步分析方法，后面再做其他方面的優(yōu)化，使色譜峰之間的分離度、峰形、峰高、峰寬滿足要求。下面我們就來仔細(xì)講講反相色譜分析方法的開發(fā)。

一、色譜柱的選擇：

高效液相色譜分析中，色譜柱的選擇直接影響了分離效果的好壞，選擇合適的色譜柱可以縮短方法開發(fā)所需的時(shí)間，并且使方法更具穩(wěn)定性。但是我們要清楚現(xiàn)在商品化的液相色譜柱比比皆是，根據(jù)色譜柱的參數(shù)可以給我們提供一個(gè)初步的選擇，但由于各個(gè)儀器廠商的填料技術(shù)和鍵合技術(shù)都有差異。即使都是C18柱，不同品牌、同一品牌不同系列都有不同的功能，有能耐受低pH值的、有耐高溫的、有適合堿性樣品的等等。那就要求我們要對(duì)各種類型的色譜柱做充分的了解之后，才能做出合適的選擇。

二、流動(dòng)相的選擇

一般來說，反相LC 的流動(dòng)相包括水和作為改性劑的乙腈或甲醇。改性劑還有四氫呋喃（THF）和異丙醇。反相色譜中流動(dòng)相中水相的pH和離子強(qiáng)度在開發(fā)對(duì)條件微小變化不敏感的耐用方法中非常重要。對(duì)于離子型化合物，典型樣品的保留隨 pH 改變而明顯變化。在這類反相系統(tǒng)中，控制 pH 對(duì)于保留和選擇性的穩(wěn)定非常重要。通常在 pH 2 到 4 條件下，保留時(shí)間對(duì)pH的微小改變穩(wěn)定性*高，因此色譜工作者將這一pH范圍作為大多數(shù)樣品方法開發(fā)的起始pH，包括堿性化合物和一般的弱酸。

為了有較好的重現(xiàn)性，所用的 pH 應(yīng)高于或低于待分離溶質(zhì)pKa或pKb上下一個(gè)pH單位。如果不清楚分析物的pKa，建議大家測(cè)試一種以上流動(dòng)相 pH 可提供*好結(jié)果。大多數(shù)反相柱都可以在pH 2-8條件下使用，這樣為分離選擇*佳流動(dòng)相 pH 提供了較寬的范圍。流動(dòng)相 pH 對(duì)色譜分離的影響有多種方式。根據(jù)所分析的化合物，pH可能影響選擇性、峰形和保留。如果是可離子化的化合物，如酸或堿，保留因子和選擇性隨 pH的改變變化非常明顯，如果是非極性較強(qiáng)或中性的化合物，pH 對(duì)分離度和保留的影響一般不明顯。

三、波長的選擇

做分析方法開發(fā)我們需要二極管陣列檢測(cè)器，選擇檢測(cè)波長和做色譜峰純度檢查，通過色譜 峰純度檢查來保證主峰里沒有掩蓋其它雜質(zhì)，做純度檢測(cè)對(duì)波長選擇的要求比較簡單，原則 是把盡量多的雜質(zhì)在色譜圖上體現(xiàn)出來。很多雜質(zhì)只有在低波長下才有紫外吸收，所以我們 選擇盡可能低的波長，乙腈的截止波長在 190~195nm，用乙腈做流動(dòng)相檢測(cè)波長可以選擇 在 210~220nm。也有公司要求分別選取產(chǎn)品紫外吸收*強(qiáng)的波段和 210~220nm 兩個(gè)波段做 對(duì)比，哪個(gè)純度低以哪個(gè)為準(zhǔn)，這樣可以更嚴(yán)格的控制產(chǎn)品的質(zhì)量。

四、分析方法的優(yōu)化

01

改變梯度斜率

更緩的梯度斜率可以提高分離度，降低梯度斜率將降低靈敏度， 更陡的梯度斜率可能壓縮色譜峰，經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致分離度的降低， 增加梯度斜率將增加靈敏度， 改變梯度斜率時(shí)要平衡峰高與分離度的關(guān)系。

02

改變柱溫

溫度會(huì)影響色譜分析中的每一個(gè)化學(xué)過程，例如增加溫度會(huì)降低移動(dòng)相的粘度，如果流動(dòng)速度恒定將導(dǎo)致系統(tǒng)背壓降低，高溫將改變固定相和流動(dòng)相之間的分配速率，然而由于提高了被測(cè)物分散性，會(huì)加快優(yōu)化線性速度。對(duì)溫度變化敏感的化合物，溫度的微小變化都會(huì)導(dǎo)致選擇性發(fā)生獨(dú)特變化。在這里我們要注意選擇柱溫一要考慮色譜柱的承受范圍，二要考慮該溫度下，檢測(cè)成分是否會(huì)降解。

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綜上所述，大家對(duì)液相色譜儀分析方法開發(fā)你學(xué)會(huì)了嗎，有了一個(gè)了解，選擇一家有靠譜售后的實(shí)驗(yàn)室儀器廠家也能幫大家解決很多儀器上的小問題，以上就是今天的全部內(nèi)容了，如需了解更多請(qǐng)閱讀《氣相色譜儀應(yīng)該怎么去操作呢？2022氣相色譜儀的操作指南分享》